Rabia este o zoonoza majora pentru care tehnicile de diagnostic au fost standardizate international. Atata vreme cat nu exista leziuni patognomonice evidente pentru rabie, diagnosticul poate fi efectuat numai in laborator. Tehnicile de laborator se executa de preferinta numai pe tesut din sistemul nervos central (SNC) prelevat din cutia craniana. Tesuturile preferate sunt hipocampul, cerebelul si bulbul

MATERIAL SI METODA

Pe baza datelor inregistrate in laboratorul de virusologie din cadrul LSVS Iasi in decursul aniilor 2002 – 2008 (lunile ianuarie-februarie), pe teritoriul judetului Iasi s-a constatat o crestere a incidentei turbarii la animalele salbatice si domestice. Cele mai multe cazuri de turbare au fost confirmate la vulpi, al caror numar a crescut alarmant. In majoritatea cazurilor, vulpile bolnave au patruns in localitati si chiar in curtile oamenilor, crescand riscul raspandirii turbarii la animale domestice si la om prin muscatura, zgarietura etc.

In perioada de studiu analizele de laborator au fost efectuate pe un numar de 639 probe, prin trei metode de lucru si anume: testul de imunofluorescenta directa pe amprete de creier (IFD), examenul histologic si bioproba de soareci albi de laborator, au fost confirmate la 40 de cazuri de turbare la animale salbatice si domestice. Cazuistica anuala a variat intre 0 (in 2003) si 23 (in 2008), numarul cel mai mare de cazuri inregistrandu-se la vulpi (80%) si mult mai mic la taurine (5%), caine, pisica, jder, dihor, porc, vidra (cate 2,5%).
Suplimentar au fost investigate 15 taurine, 13 ovine, 5 suine si alte specii de animale domestice, salbatice si de laborator.

Ridicarea anamnezei si examinarea clinica si anatomopatologica au fost urmate de prelevarea probelor pentru examenele de laborator. Pentru investigatiile histopatologice au fost recoltate cate 5 fragmente din diferite segmente ale SNC care au fixate in acetona, incluse in parafina si colorate prin metodele: HE, HEA, Mann, Sellers.

REZULTATE OBŢINUTE

Turbarea la taurine. Au fost luate in studiu 10 taurine (9 adulte si un vitel), care au murit sau au fost sacrificate de necesitate datorita unor simptome neurologice grave sugerand rabia. Examinarea anatomopatologica a evidentiat impastarea rumenului si foiosului la o vaca, plagi muscate localizate la extrimitatile distale ale membrelor posterioare, escoriatii, echimoze in diverse regiuni corporale. Leziunile histopatologice, recomandate de literatura de specialitate sunt clasificate, in functie de topografie si importanta in:

Leziuni cerebrospinale (nevraxiale): nespecifice (degenerare neuronala, glioza,  mansoane perivasculare, noduli Babes, leptomeningita si ganglionevrita, uneori si ependimita) si specifice, patognomonice (corpusculii virali intracitoplasmatici    Babes Negri) si extra nevraxiale (sialita nesupurativa cu necroze si incluzii in celulele epiteliale ale glandelor salivare (sialoadenita parotida nesupurativa cu necroze si incluzii la rumegatoare produsa de virusul silvatic si uneori incluzii in retina si in medulosuprarenala) .

Leziunile nevraxiale acute sunt reprezentate de ectazii vasculare si edem (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3), microtromboze si hemoragii diapedetice in spatiile Virchow-Robin sub aspectul unor inele perivasculare, situate mai frecvent in etajele inferioare ale creierului si in maduva spinala unde pot deveni vizibile cu ochiul liber, precum si de o inflamatie (meningoencefalomielita) nesupurativa multifocala exprimata prin mansoane perivasculare, noduli Babes, glioza difuza, degenerare neuronala, leptomeningita si ganglionevrita . In general severitatea leziunilor reflecta durata bolii clinice, fara legatura cu perioada de latenta.

La taurinele investigate, leziunile de menigoencefalita au fost discrete sau absente.
Mansoanele perivasculare sau perivascularitele care alterneaza de obicei cu inelele hemoragice, se formeaza prin acumularea mononuclearelor in spatiile Virchow-Robin unde se dispun pe unul sau mai multe straturi. Mansoanele sunt alcatuite in special din limfocite printre care se gasesc macrofage, plasmocite si histiocite. In raport direct cu reactia inflamatorie slaba sau absenta, mansoanele sunt in numar foarte mic si foarte subtiri.

Nodulii rabici ai lui Babes sunt aglomerari de microglii si se gasesc atat in substanta alba cat si in cea cenusie. In substanta cenusie sunt precedati de microglioza focala cu satelitoza in jurul unor neuroni degenerati si apoi de neuronofagie. La rumegatoare, animale deosebit de susceptibile la infectia rabica, nodulii rabici sunt foarte mici si rari, iar prestadiile de microglioza, satelitoza si neuronofagie sunt discrete, proportionale cu gradul alterarii neuronilor, mai mic decat la alte specii, desi incluziogeneza poate fi proeminenta.

Numarul de celule gliale din noduli variaza intre 6 si 10 celule, printre ele gasindu-se si un numar variabil de limfocite si monocite -macrofage.
Microglioza difuza este si ea concordanta cu amploarea inflamatiei-meningoencefalomielita nesupurativa – de obicei slaba, rareori proeminenta. Este mai evidenta in substanta cenusie, intre punte si hipotalamus si in maduva spinala din zona cervicala(in ambele coarne, dorsale si/sau ventrale) cu variabila extensie spre bulb.

Degenerarea neuronala este variabila: de obicei foarte usoara sau minima. Totusi, in unele sectiuni leziunile alterative ale substantei nervoase sunt mai evidente si constau in necrobioza si liza celulelor Purkinje (in special), si in lichefierea focala a tesutului nervos (Fig. 4), dar chiar si in aceste situatii pot fi observate incluzii sporadice (Fig. 5, Fig. 6). Este posibil ca o parte din aceste zone de ramolitie sa fie produse de autoliza sau de fixarea defectuoasa a tesutului nervos. In unele forme usoare se constata suplimentar degenerarea oligodendrogliei si astrocitelor.

Leptomeningita limfomacrofagica (limfohistiocitara) se poate observa in formele usoare ale bolii fiind legata de inflamatia parenchimului subiacent si se exteriorizeaza prin congestie, infiltrarea edematoasa si cu celule mononucleare a piei si spatiilor arahnoidiene.

Leziunile ganglionilor nervosi nu a fost cercetata .
Periependimita nesupurativa, rara, cu evolutie difuza sau nodulara si cu acumularea celulelor limfohistiocitare sub epiteliul canalului ependimar si al ventriculului IV, nu a fost observata la taurine.

Leziunile specifice sunt reprezentate de incluziile virale prezente in citoplasma celulelor Purkinje la erbivore si mai rar, in celulele ganglionare din restul sistemului nervos, cunoscute sub numele de "corpusculii Babes-Negri" in tara noastra si "corpusculii Negri" in majoritatea tarilor occidentale.
Incluziile se formeaza in neuronii aparent normali rareori in neuronii degenerati si/sau in zonele de inflamatie severa.(Fig. 7, Fig. 8, Fig.9 )
Corpusculii au pozitie strict intracitoplasmatica, dimensiuni variind intre 1 si 30 μm , forma rotunda in corpul celular si ovala in dendrite (mai frecvent, in dendritele celulelor Purkinje); (Fig. 10) si cand sunt dubli, pot fi simetrici, “ in oglinda ” (Fig.11);  sunt unici sau multipli in aceeasi celula si inconjurati de un halo clar subtire. Au tendinta de a se forma in neuroni cei mai voluminosi, in special in celulele Purkinje din cerebel si in celulele piramidale din hipocamp la taurine.
Incluziile se evidentiaza specific prin metodele de colorare Mann, Lentz, Sellers, Murontev etc pe amprete sau pe sectiuni obtinute prin includere in parafina, dar pot fi observate si in coloratile  HE sau HEA sub forma corpusculilor eozinofilici. In microscopia optica, in deosebi in coloratia Mann, corpusculii au o structura complexa, morulata fiind constituiti dintr-o masa fundamendala oxifila si granulatii bazofile – corpusculii Volpino.(Fig. 12, Fig.13.)

La vitel, leziunile sunt asemanatoare, iar corpusculii au fost prezenti atat in cerebel cat si in cornul lui Ammon
Cercetarile de microscopie electronica ale lui Miyamoto si Matsumoto (1967, citati 40) au demonstrat structura foarte complexa a acestor incluzii. Ele sunt agregate de nucleopcapside virale care se transforma intr-o matrice omogena. In interiorul unui corpuscul se gasesc una sau mai multe zone clare mici numite corpi interiori (engl. “inner bodies”) care reprezinta invaginari ale citoplasmei cu componentele ei si virioni maturi ce inmuguresc din reticulul endoplasmic. Incluziile lipsite de “inner bodies” sunt cunoscute sub numele corpii Lyssa.

Numarul corpusculilor variaza in functie de diversi parametri. Incluziile sunt produse de virusul salbatic, si doar in proportie de 30% de virusul de strada, dar lipsesc in infectia cu virusul fix. Incluziogeneza este independenta cu perioada de incubatie, dar dependenta de durata bolii clinice, putand sa lipseasca la animalele eutanasiate inainte de aparitia semnelor clinice; incluziogeneza este invers proportionala cu gradul degenerarii neuronale si cu modificarile inflamatorii din tesutul nervos. Topografia nevraxiala este dependenta de specia infectata. Ele se produc aproape constant la soarecele alb care este animalul – test.
Incluziile rabice Babes-Negri vor trebui diferentiate de incluziunile numeroase, acidofile, stralucitoare, unghiuloase, cu diametrul pana la 1 μm care pot apare in neuronii mai mari din bulb si maduva la oile batrane .

Virusurile fixe care si-au pierdut capacitatea de negrigeneza, uneori si infectiile negrigene, pot exprima corpusculi hipercromatici intranucleari care pot fi observati in celulele stratului extern al cornului lui Ammon.
Prezenta corpusculilor Babes-Negri este un indiciu sigur de turbare. Absenta lor insa, nu exclude existenta bolii.
Fata de acest mers al infectiilor acute, se admite si existenta unor infectii latente, care se acutizeaza cu ocazia unor socuri vaccinale, a gestatiei, oboselii nervoase, etc., precum si forme cronice (la carnivore)(Braund, 1986).

Concluzii

1.Turbarea a fost diagnosticata la noua taurine adulte si la un vitel prin intermediul a trei teste de laborator; IFD, histologic si bioproba pe soareci albi.

2. Histologic, la taurine au fost identificate tulburari circulatorii nespecifice, si hemoragiile inelare perivasculare, discrete, leziuni degenerative ale celulelor Purkinje si ale celulelor ganglionare din cornul lui Ammon, variind ca intensitate de la minime la notabile si leziunile proliferative de tip glial minore.

3. Incluziogeneza este totdeauna prezenta in cerebel si inconstant in cornul lui Ammon si in trunchiul cerebral la adulte, in cerebel si in cornul lui Ammon la vitel.

4. Corpusculii intracitoplasmatici apar acidofili, unici sau multipli, inegali, rotunjiti, ovalari sau muriformi, omogeni sau cu granulatii bazofile Volpino, uneori simetrici (topografie “ in oglinda ”), localizati in corpul celular sau in prelungirile axonale. La vitel, incluziile au fost prezente atat in cerebel, cat si in cornul lui Ammon.

BIBLIOGRAFIE

1.ALEXANDRU, N.,  - Morfopatologie: Investigatia histologica in diagnostic, tipo. L.C.S.V.D., Bucuresti, 1995.
2.BRUGERE PICOUX, JEANNE – Actualites en patologie bovine. Ecole nationale veterinaire d’Alfort, Edition ”Chaire de pathologie medicale du betail et des animaux de basse – cour” Jeudi, 20 juin 2002.
3.FONTAINE, J.J. - UP D’Histologie et Anatomie pathologique DSBP – ENVA, Anatomie patologique speciale, lesions du systeme nerveux, september 2002.
4.GUARDA F., MANDELLI G. – Tratatto di Anatomia Patologia Veterinaria. Ed. UTET Torino, 1989.
5.McGAVIN, D. Mc., ZACHARY, J.F., - Pathologic Basis of Veterinary Disease. Fourth Edition. Mosby Elsevier, 2007.
6.JUBB, K.V.F., HUXTABLE, C.R. – The nervous system. In: JUBB, K.V.F., KENNEDY, P.C., PALMER, N. – Pathology of Domestic Animals. Academic Press, New York – London, 1993.
7.PAUL, I. – Etiomorfopatologie veterinara. Vol. I., Edit. ALL, Bucuresti, 1996.
8.PERIANU T. – Bolile infectioase ale animalelor. Viroze. Vol. II, Ed. Universitas XXI, lasi, 2005.

Autori:

dr. Stefania MERTICARIU-ANDERCO - LSVS Iasi,
prof.dr. Otilia COTOFAV – FMV Iasi,
dr. Gabriela URSACHI - LSVS Iasi,
dr. GeanniAGAVRILOAIEI - LSVS Botosani.